【受賞者】
佐賀大学大学院農学研究科
修士課程2年　嘉数　百合（かすう　ゆり）

【受賞した賞の名称】
優秀ポスター賞

【受賞先】
第62回電子スピンサイエンス学会年会

【受賞した日】
2023年11月3日

【受賞した研究の題目】
急速凍結-電子常磁性共鳴（EPR）法を用いた金属酵素活性中心における構造変化の温度依存性

著者：嘉数　百合、堀谷　正樹
佐賀大学院・農学研究科

【受賞につながった研究内容】
　酵素は化学反応を触媒する生体高分子で、生体内化学反応のほとんどは酵素が行っています。酵素の特徴は、一般的な化学触媒とは異なり、低エネルギーコストで化学反応を触媒することや環境負荷がないことが挙げられます。ところが、一般的な酵素は温度などの環境因子に非常に弱い側面も持っています。
　これまで好熱菌由来耐熱性酵素は温度などに強いため産業用などとして注目を浴び、基礎研究から応用研究が盛んに行われてきました。それに対し、低温菌や好冷細菌がもつ低温適応酵素は耐熱性酵素よりも高活性ですが、熱に対して弱いと考えられてきたため、基礎研究・応用研究ともにあまり進んでいません。ところが、近年になりいくつかの熱安定性の高い低温適応酵素が報告されつつあります。しかし残念ながら現在の科学知見ではこの要因を解き明かすことは出来ていません。私たちの研究グループでは、このような高熱安定・低温適応の両方を達成するためのメカニズムを分子レベルで明らかにし、産業利用酵素へ発展させる研究を行っています。
　今回の研究対象は活性中心に2価マンガンイオンを持つ無機ピロホスファターゼ（PPase）です。PPaseは無機ピロリン酸を加水分解し、無機リン酸を産出する化学反応を触媒する金属酵素です。南極産好冷細菌由来PPase（Sh-PPase）は高熱安定性の低温適応酵素であることが報告されています。そこで私たちは、Sh-PPaseについてX線結晶構造解析および電子常磁性共鳴（EPR）法を用いて幅広い温度での構造解析を行い、高熱安定・低温適応機構のひとつの要因が活性中心のみ柔軟性を高めていることに起因する可能性を見出してきました。そこでこの部位特異的な柔軟性がSh-PPaseだけに特徴的であるのかを検証するため、本研究では中温菌である枯草菌由来PPase（Bs-PPase）についての幅広い温度での構造解析を進めました。
　EPR法では、活性中心周辺の構造情報を取得することが出来ます。ところが測定は極低温（4～80 K）で行うため、酵素試料を凍結する必要があります。通常の凍結方法だと酵素は凍結に時間がかかり、凍結温度での構造解析しか出来ません。私たちはこの問題を解決するために、マイクロ秒オーダーで瞬間凍結出来る急速凍結装置を自作しました。さらに0～60℃の酵素の構造解析が可能な温調ユニットを組み込むことで、幅広い温度での酵素試料を作成しました。これらの試料におけるEPR解析の結果、Bs-PPaseでは、Sh-PPaseに特徴的であった活性中心の柔軟性が見られないことが明らかになりました。つまり、Bs-PPaseは一般的な化学触媒と同様に熱ゆらぎで酵素活性が増大するのに対し、Sh-PPaseは従来から考えられていた酵素全体を低温適応させるのではなく、活性に必要な部位のみ柔軟性を高めることで低温域の活性を増大させていることが明らかになりました。

【その他PRしたい特記事項】
　これまで酵素の高熱安定性は酵素全体を固くすること、低温適応は酵素全体を柔軟にすることで達成されていると考えられてきましたが、本研究により活性に重要な部分のみの柔軟性を上げ、その他の大部分は固いままにすると、高熱安定性・低温適応化した酵素が創出できる可能性を見出しました。今後はタンパク質工学的な産業利用による広範な分野への貢献を目指して、様々な酵素に本知見を導入することで自在に安定性・低温適応機構が導入できるか検証します。
　本研究はJSPS科研費18H02412、21K18937、22H04816、23H02143の助成を受けたものです。また本研究の一部は文部科学省「マテリアル先端リサーチインフラ」事業（課題番号JPMXP1223MS1004）の支援を受け自然科学研究機構、分子科学研究所で実施されました。

【教員活動ＤＢのリンク先】
https://research.dl.saga-u.ac.jp/profile/ja.18d258ee2e9779cc59c123490551be02.html

受賞した嘉数百合さんと堀谷正樹准教授

【本件に関する問い合わせ先】
　佐賀大学農学部生命機能科学コース
　准教授　堀谷　正樹
　E-Mail：horitani@cc.saga-u.ac.jp